Behördenbezeichnung mit Staatswappen: Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit

Foschungsprojekt:
Epidemiologie für Diphtherie-Erreger und Erreger der Lyme Krankheit

Kurzbeschreibung

Zielsetzung des Projektes war die Etablierung von Multilocus Sequence Analysis (MLSA) für Corynebacterium diphtheriae, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis und Borrelia burgdorferi sensu lato als zukunftsweisende Maßnahme für molekulare Epidemiologie und als Basis zur Verbesserung diagnostischer Methoden. Weiterhin sollten die Daten zur Beurteilung der Stammsammlungen des Konsiliarlabors Diphtherie und des NRZ für Borrelien in einem globalen Kontext dienen.

Multilocus Sequence Analysis (MLSA) für Corynebakterium

Das für C. diphtheriae existierende MLSA System, das in der PubMLST.org Datenbank vorhanden ist, wurde daher übernommen. Das MLSA System beruht auf der Sequenzanalyse von sieben konservierten Genen, nämlich atpA, dnaE, fusA, odhA, rpoB, dnaK und leuA.
C. diphtheriae Stämme (n=65) der Stammsammlung wurden mittels bestehender Primer amplifiziert und sequenziert und Sequenz-ausgewertet. Für C. pseudotuberculosis konnte für 11 Stämme eine Amplifizierung erfolgreich durchgeführt werden.

Um eine möglichst hohe Vergleichbarkeit zwischen Corynebakterienspezies zu erhalten, wurde bei der Entwicklung und Etablierung eines MLSA Systems für C. ulcerans und C. pseudotuberculosis darauf geachtet, die gleichen Gene wie für C. diphtheriae zu verwenden. Für fünf der sieben konservierten Gene konnten die Primer von C. diphtheriae verwendet werden. Primer für C. ulcerans für die beiden Gene dnak und leuA wurden speziell anhand der C. ulcerans Vollgenomsequenz des Stammes 809 aus GenBank designed und die MLST PCR für diese Spezies am LGL etabliert. Insgesamt wurden bei 44 Isolaten der Stammsammlung des Konsilliarlabors Diphtherie (NCLoD), (n=31 von Humanpatienten und n=13 von Tieren) mittels PCR erfolgreich die MLST Gene amplifiziert und sequenziert.

Die Sequenzen wurden in die MLST Datenbank (http://pubmlst.org/cdiphtheriae/) eingereicht, um Allelenummern und Sequenztypnummer zu erhalten. Die Sequenzen wurden mit der Software Phyloviz analysiert, um Korrelationen von Diphtherie-Toxinpositivität und Sequenztyp sowie biologische Herkunft (Human, tierisch; Abb. 1B) zu visualisieren.

MLSA für den Borrelia burgdorferi sensu lato Spezieskomplex

Für den Komplex der Lyme borreliose Spirochäten wurde ein MLSA System etabliert, das ebenfalls in der PubMLST.org Datenbank vorhanden ist (http:// pubmlst.org/borrelia/).
Die Methode (PCR Amplifizierung, Sequenzierung und Sequenzanalyse mittels entsprechender Software) wurde erfolgreich im Nationalen Referenzzentrum für Borrelien am LGL in Oberschleissheim etabliert. Insgesamt wurden 74 B. garinii (n=44) und B. bavariensis (n=30) Stämme sowie 138 Stämme von B. burgdorferi sensu stricto (Patientenisolate n=35, Zecken-DNA n=25) und B. afzelii (Patientenisolate n=78) mittels MLST typisiert.
Die Auswertung der B. bavariensis Isolate bestätigte die genetische Homogenität der Europäischen Population von B. bavariensis und diente als Grundlage zur Validierung der Spezies.

Die Auswertung der B. afzelii und B. burgdorferi sensu stricto Sequenzen ergab, dass Europäische B. burgdorferi sensu stricto Stämme im Vergleich zu B. afzelii signifikant häufiger an Symptomatik beteiligt sind, die auf Invasivität der Borrelien schließen lassen. Die Anwendung von MLSA auf Europäische Borrelien Stämme erlaubte eine vergleichende Analyse mit Stämmen aus USA, die sich bereits in der Datenbank befanden. Dabei wurde festgestellt, dass von einigen Patienten Stämme isoliert wurden, die eng verwandt mit amerikanischen Stämmen sind. Weitergehende Untersuchungen mittels Vollgenomsequenzierung könnten Aufschluss darüber geben, ob diese Patienten die Infektion evtl. im Ausland erworben haben.

Die Verwandtschaft von europäischen und amerikanischen B. burgdorferi s.s. Stämmen verdeutlicht, dass einige Patientenisolate aus Europa denselben Sequenztyp aufweisen, wie amerikanische Stämme.

Laufzeit: 2012 bis 2013

Abschlussbericht

Abschlussbericht zum Projekt: Epidemiologie für Diphtherie-Erreger und Erreger der Lyme Krankheit

Publikation aus diesem Projekt