Behördenbezeichnung mit Staatswappen: Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit

Forschungsprojekt: Quantitative molekularbiologische Bestimmung allergener Zutaten in Lebensmitteln mittels real-timePCR

Kurzbeschreibung

Mit der nahenden Einführung von Schwellenwerten für die Kennzeichnung allergener Zutaten treten Methoden zur quantitativen Bestimmung dieser Allergene in den Vordergrund. Als Alternative zu den etablierten immunologischen Nachweisverfahren bieten Real-time PCR-Systeme prinzipiell die Möglichkeit zur Quantifizierung auf DNA-Ebene, mit den Vorteilen der höheren Spezifität, der höheren Stabilität des Analyten (DNA) und der Nachweisbarkeit allergener Zutaten, für die bislang keine ELISA-Verfahren existieren.

Eine Strategie zur Quantifizierung besteht, in Analogie zu den Verfahren aus der Analytik gentechnisch veränderter Lebensmittel, darin, aus dem Verhältnis der Kopienzahlen einer Analyt-spezifischen Zielsequenz und einer Referenz-spezifischen Zielsequenz auf den Anteil des Analyten zu schließen. Ein zu diesem Zweck nötiges ubiquitäres Referenzgen, welches in allen Organismen in definierter, bekannter und konstanter Kopienzahl vorkommt, ist in der Praxis nicht realisierbar. Daher wurde ein methodischer Ansatz verfolgt, bei dem das Gen in Form eines in definierter Menge zugesetzten Standardorganismus der Analyse zugegeben wird. Aus dem Vergleich der mittels quantitativer PCR messbaren Kopienverhältnisse in 100% Analyt (allergene Zutat plus Referenz) und x% Analyt (Probe plus Referenz) kann der Anteil der allergenen Zutat in der Probe berechnet werden. Das Prinzip der Methodik war am Beispiel der quantitativen Bestimmung von Buchweizen in Mehlen mit Hilfe des Referenzorganismus Limonium sinuatum von Hirao et al. 2006 gezeigt worden.

Im Rahmen dieses Projekts wurde versucht, das für Limonium sinuatum publizierte Referenz-PCR-System im Hinblick auf seine Kompatibilität mit den bereits etablierten allergenspezifischen PCR-Systemen zu optimieren. Ein effizientes Limonium-Nachweissystem mit Standard-PCR-Programm konnte durch ein Neudesign von Primern und Sonde erreicht werden.

Für die Erstellung optimierter und stabiler Standardgeraden, die in der quantitativen PCR zur Bestimmung der Kopienzahlen erforderlich sind, wurden mehrere Hybridmoleküle entworfen und hergestellt, die jeweils die beiden Zielsequenzen von Analyt und Referenz auf einem einzigen PCR-Amplifikat enthalten.

Das Verfahren nach Hirao wurde zunächst auf die Quantifizierung des Sojaanteils in Mehlmischungen und des Sellerieanteils in Brühwürsten übertragen. In beiden Fällen zeigten sich die Grenzen der Anwendbarkeit des Limonium-Systems als Referenz, wenn die Analyt-spezifischen PCR-Systeme, wie derzeit bei Soja und Sellerie, auf single-copy Genen beruhen: Während die Kopienzahlen der zugesetzten Referenz am oberen Ende bzw. außerhalb der Standardgeraden lagen, befanden sich die Kopienzahlen der Zielsequenz eines niedrig konzentrierten Analyten bereits an der Nachweisgrenze. Die Diskrepanz konnte auf zwei Arten behoben werden:

Durch Verwendung von Limonium als Referenz zur Quantifizierung von Lupine, dessen Zielsequenz ebenso auf einem multi-copy DNA-Abschnitt liegt. Quantitative Bestimmungen des Lupinenanteils in einer dotierten Weizenmehlmischung mit 10 mg/kg zeigten Wiederfindungen von 74-153%. In handelsüblichen Backmischungen wurden mit dieser Methodik vergleichbare Ergebnisse erhalten wie mit dem alternativen PCR-Verfahren der matrixadaptierten Kalibration.

Die zweite Variante bestand in der Verwendung von single-copy Referenzsystemen für die allergenspezifischen Nachweismethoden auf Basis von single-copy Genen. Dies wurde zunächst exemplarisch an Hand der quantitativen Bestimmung des Sojaanteils in Mehlmischungen mit Hilfe von Selleriesaat als Referenz gezeigt. Nach dem sich die Strategie als erfolgversprechend gezeigt hatte, wurde ein neues Referenzsystem auf Basis des Anthocyanidinsynthasegens von Gypsophila elegans (Schleierkraut) entwickelt und die Anwendbarkeit zur Quantifizierung von Sellerie in Brühwürsten umfangreich validiert. Die von Hirao et al. vorgeschlagene Strategie der Quantifizierung mit internem Standard und Real-time PCR konnte damit erfolgreich auf die Bestimmung von Sellerie in Brühwürsten übertragen werden. Die analytischen Schwankungen waren trotz Standardisierung des Verfahrens dennoch relativ hoch, was jedoch generell im Konzentrationsbereich 10-100 mg/kg nicht ungewöhnlich ist.

Eine Halbierung des Analysenaufwandes könnte durch Kombination der beiden PCR-Systeme in einer Duplex-PCR erreicht werden. Erste Versuche zeigten das beide Systeme unter optimalen Bedingungen kompatibel sind. Dies galt auch für die Kombination von Lupine- und Limonium-PCR.

Daneben wurde Gypsophila mit Erfolg als Referenzsystem zur Quantifizierung von Sesam eingesetzt. Die Untersuchung von tiefgekühlten Backwaren brachte im Rahmen der Schwankungen vergleichbare Ergebnisse wie das alternative Verfahren der matrixadaptierten Kalibration und ein entsprechende ELISA-Verfahren. Ergänzende Untersuchungen zur Nachweisbarkeit verschiedenster Allergene in unterschiedlichen Matrices im Rahmen deutschlandweiter Arbeitsgruppen (§64, GDCh), Bachelor- und Diplomarbeiten sowie nationalen und internationalen Ringversuchen rundeten das Projekt ab. Die im Rahmen eines Vorgängerprojekts entwickelte Nachweismethode für Sellerie wurde im Laufe des aktuellen Projekts grundlegend überarbeitet, den Vorgaben des CEN angepasst und dort als erste europäische Norm im Bereich molekularbiologischer Nachweisverfahren für Allergene eingereicht.

Laufzeit: 2008-2010