Behördenbezeichnung mit Staatswappen: Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit

Forschungsprojekt: Identifizierung von probiotischen Bakterien sowie Starterkulturen in Lebensmitteln mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie

Kurzbeschreibung

Für die lebensmittelrechtliche Bewertung probiotischer Lebensmittel ist es wichtig, die deklarierten und beworbenen Bakterienspezies eindeutig und sicher identifizieren zu können. Eine Überprüfung der Identität der Kulturen ist bisher nur mit aufwändigen molekularbiologischen Methoden wie Pulsfeld-Gelektrophorese (PFGE) möglich, so dass bisher keine Überwachung probiotischer Lebensmittel vorgenommen werden konnte. In diesem Projekt soll die Datenbank der MALDI-TOF MS um Spektren von bakteriellen Starterkulturen für fermentierte Milchprodukte sowie um Spektren von häufig eingesetzten probiotischen Bakterienstämmen erweitert werden. Dabei soll überprüft werden, inwieweit die Spektren innerhalb der Gruppe der Milchsäurebakterien eine Identifizierung auf Spezies-, Subspezies- bzw. Stamm-spezifischer Ebene ermöglichen. Die bakteriellen Starterkulturstämme sowie die probiotischen Stämme werden von dem dänischen Starterkultur-Hersteller Christian Hansen A/S in Reinkulturen zur Verfügung gestellt. Christian Hansen fungiert dabei als externer Kooperationspartner, der auch die hauseigenen Identifizierungsmuster mittels PFGE zur Evaluierung der Ergebnisse zur Verfügung stellt.

Stämme von Leuconostoc spp. sind wichtige Vertreter der bakteriellen Starter-kulturen. Innerhalb der Gattung Lactococcus kann man bedeutende probiotische Stämme finden. In dieser Studie wurden Stämme von Leuconostoc spp. sowie Lactococcus lactis herangezogen, um die Einsatzbarkeit der MALDI-TOF MS zur Identifizierung von Milchsäurebakterien auf Stammebene zu testen. Eine Identifizierbarkeit auf Stammebene hat sowohl für die Lebensmittelüberwachung als auch für die industrielle Anwendung eine große Bedeutung.

Bei der MALDI-TOF MS Analytik konnten charakteristische Massenspektren für alle untersuchten Stämme erzeugt werden. Für die Identifizierung wurden nur eindeutige und reproduzierbare Protein-Peaks zwischen 3.000 und 9.000 Dalton ausgewählt, welche ein S/N Verhältnis (Signal to Noice ratio) größer als 5 zeigten. Eine Vorbehandlung mit 12,5 µg / ml Lysozym für Stämme von Leuconostoc spp. bzw. mit 50 U / ml Mutanolysin für Stämme von Lactococcus lactis erhöhte die Chance zusätzliche und spezifische Peaks zu generieren und sorgte für reproduzierbare Massenspektren. Für alle Stämme dieser Studie wurden sowohl das Standardverfahren zur Proteinextraktion sowie das optimierte Verfahren mit enzymatischer Vorbehandlung parallel durchgeführt.

Für jeden Stamm wurden mindestens 20 qualitativ hochwertige Spektren generiert, welche im MALDI BiotyperTM für die Generierung von MSP (Referenzspektren) und die Implementierung der Proteinspektren in die LGL inhouse Datenbank verwendet wurden. Im Anschluss wurden diese 20 Spektren in dem biostatistischen Programm ClinProTools weiter bearbeitet. Das Programm ClinProTools wurde dafür eingesetzt stamm-spezifische Peaks oder Kombinationen von Peaks zu identifizieren, welche für die Abtrennung der einzelnen Stämme von Bedeutung sind. Nur charakteristische und reproduzierbare Protein-Peaks wurden übernommen. Außerdem wurde in ClinProTools eine Clusteranalyse durchgeführt. Für Lactoccoccus lactis war es möglich, die Unterart eindeutig und reproduzierbar zu diskriminieren. Die Subspezies Diskriminierung von Lactococcus lactis war auch bereits mit anderen genotypischen Methoden beschrieben worden (16S rRNA Gen bei Tanigawa et al., 2010). Im Gegenteil dazu wird die Subspezies Identifizierung von Leuconostoc mesenteroides nur phänotypisch (API 50) bestimmt und konnte mit MALDI-TOF MS nicht reproduziert werden. Insgesamt konnten 12 der 24 Stämme von Leuconostoc spp. und 11 der 28 Stämme von Lactococcus lactis mittels MALDI-TOF MS stammspezifisch identifiziert werden. Die übrigen 14 Stämme von Leuconostoc spp. und 17 Stämme von Lactococcus lactis waren nicht reproduzierbar voneinander trennbar, weil ihre MALDI-TOF MS-Profile zu ähnlich waren und Gruppen von 2 bis 6 Stämmen mit identischen Proteinspektren-Mustern bildeten.

Wir können daher aus dieser Studie schließen, dass MALDI TOF MS zur Differenzierung von Stämmen unterhalb der Artebene bedingt geeignet ist. Mit geeigneten bioinformatischen Programmen können die Stämme zwar reproduzierbar bestimmten Clustern zugeordnet werden, aber eine eindeutige und reproduzierbare Identifizierung von Einzelstämmen war in dieser Studie nur teilweise möglich und erfordert derzeit noch einen sehr hohen manuellen Arbeitsaufwand, da die Programme dahingehend noch nicht automatisiert angewendet werden können. Es steckt aber viel Potential in der MALDI-TOF MS Analytik für eine Identifizierung von bakteriellen Isolaten und es wird hierfür sicher bald geeignetere Computerprogramme mit automatisierten Auswerte-Tools geben. Die Analyse von Probiotika und Starterkulturen auf Spezies- Subspezies- und Clusterebene ist mit MALDI-TOF MS sehr gut einsetzbar in der mikrobiologischen Lebensmittelanalytik.

Laufzeit: 2009-2012