Behördenbezeichnung mit Staatswappen: Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit

Forschungsprojekt: Kontrollverfahren für Kontaminationen durch Lentiviren in gentechnischen Anlagen

Kurzbeschreibung

Im Rahmen dieses Projektes wurde das Konzept einer Stufenanalytik zur Überwachung gentechnischer Arbeiten mit rekombinantem HIV-1 und HIV-1- basierten lentiviralen Vektoren entwickelt und validiert.

Hauptelement der Stufenanalytik ist eine im Rahmen dieses Projekts am LGL entwickelte und validierte quantitative (RT-)PCR zum Nachweis viraler RNA bzw. proviraler DNA. Dieses Verfahren soll zum Screening auf HIV-1 Genomelemente eingesetzt werden. Im Rahmen der Validierung wurde das LGL in-house Verfahren mit drei publizierten bzw. kommerziell erhältlichen Nachweisverfahren verglichen und zeichnete sich hier durch eine hohe Sensitivität und Effizienz aus. Weiterhin besitzt das LGL in-house Verfahren, im Gegensatz zu den drei bereits existierenden Verfahren, erstmals eine integrierte (MS2-Phagen basierte) Extraktions- und Inhibitionskontrolle und einen cRNA-Titrationsstandard.

Da der Nachweis viraler Nukleinsäuren nur sehr eingeschränkte Aussagen über das Vorhandensein von Virus- bzw. Vektorpartikeln erlaubt, wurden zwei weitere Verfahren zum Nachweis des p24 Kapsidantigens und zum Nachweis aktiver Reverser Transkriptase (RT) etabliert und validiert. Beide Verfahren zeichnen sich durch eine Nachweisgrenze von ungefähr 105 Virus- bzw. Vektorpartikeln aus. Der p24 Antigennachweis ist dabei universell einsetzbar, kann jedoch nicht zwischen vermehrungs- bzw. funktionsfähigen und inaktivierten Viren bzw. Vektoren unterscheiden. Der Nachweis aktiver RT wäre im Gegensatz dazu zumindest ein Hinweis auf das Vorliegen eines „aktiven“ Virus bzw. Vektors. Kritisch für den RT-Assay waren jedoch Proben mit hohen Ausgangskonzentrationen doppelsträngiger DNA, wie zum Beispiel Überstände oder Pellets von Zellkulturen. Um dieses Problem zu lösen wird derzeit ein modifizierter RT-Assay, der sogenannte „product-enhanced Reverse-Transkriptase- (PERT-) Assay“ am LGL etabliert und validiert.

Die Kombination der drei entwickelten bzw. etablierten und validierten Verfahren zum Nachweis viraler Nukleinsäuren und Strukturproteine ermöglicht eine relativ exakte Beurteilung von Proben, die HIV-1 oder HIV-1-basierte lentivirale Vektoren enthalten.

Laufzeit: 2010 bis 2012

Finanzielle Förderung: Dieses Forschungsprojekt wird durch das Bayerische Staatsministerium für Umwelt und Verbraucherschutz (StMUV) gefördert.