Forschungsprojekt: Etablierung von Methoden für die experimentelle Überwachung gentechnischer Arbeiten in gentechnischen Anlagen gemäß §25 GenTG: Nachweis replikativer Adenoviren (Ad5)
Adenoviren sind behüllte Viren, welche weit verbreitet auftreten. Derzeit sind circa 50 verschiedene Serotypen klassifiziert. Sie zeichnen sich durch eine hohe Stabilität gegenüber chemischen (alkoholische Desinfektionsmittel) sowie physikalischen Einwirkungen aus und tolerieren extreme pH-Werte. Das stabile ikosaedrische Kapsid der 70 – 90 nm großen Viren und die Abwesenheit einer empfindlichen Hülle führen zu einer lang anhaltenden Infektiösität außerhalb des Wirtskörpers. Antikörper gegen humane Adenoviren sind in der Regel bereits bei Kindern nach dem ersten Lebensjahr nachweisbar. Die Krankheitsbilder, welche durch adenovirale Infektionen hervorgerufen werden können, reichen von respiratorischern Erkrankungen, epidemischer Konjungivitis bis zu infantiler Gastroenteritis. Adenovirus Typ 5 und weitere Serotypen können in lymphoidalem Gewebe über einen längeren Zeitraum persistieren.
Generell können alle humanen Zelllinien mit Adenoviren infiziert werden, was zur Freisetzung replikativer Viruspartikel führt. Versuche an Nagetierzellen, in welchen bereits 1984 das onkogene Potential verschiedener Adenovirus-Typen durch in vitro sowie in vivo-Untersuchungen bestimmt wurde, zeigten zwar, dass diese nur von bestimmten Adenovirus-Typen infiziert werden, dass diese Adenovirus-Typen allerdings ein onkogenes Potential in Nagetieren aufweisen. Entsprechend der Onkogenität für Nagetiere werden Adenoviren in drei Untergruppen aufgeteilt. Adenovirus-Typen, die bereits nach kurzer Latenzperiode zu einem Tumorwachstum führen (zum Beispiel Typ 12), werden in die Onkogenitätsgruppe A eingestuft. Dahingegen werden „schwach“ onkogene Adenoviren (zum Beispiel Typ 7), bei welchen erst nach langer Latenzperiode ein Tumorwachstum belegbar ist, in die Subgruppe B eingestuft. Adenovirus-Typen, welche kein onkogenes Potential (zum Beispiel Typ 5) aufweisen, gehören der Subgruppe C an. Ratten- und Hamsterzellen können jedoch in vitro durch Adenovirus Typ 5 (Ad5) transformiert werden.
In Laboratorien werden gentechnisch veränderte attenuierte Adenoviren aufgrund ihrer hohen Transduktionsfähigkeit dazu verwendet, gezielt Veränderungen im Genom von Zelllinien durchzuführen. In der Regel werden hierfür Vektoren verwendet, welche von Ad5 abgeleitet sind. Ferner werden Ad5-basierte Vektoren in vivo für den Einsatz in der somatischen Gentherapie und als Vakzine entwickelt. Die gentechnischen Veränderungen an Ad5-Vektoren werden bevorzugt in der E1- beziehungsweise E3-Gensequenz durchgeführt, was zu einer Attenuierung der Viren führt. E1-Gene sind für die produktive Infektion humaner Zellen essentiell und werden für die Transformation infizierter Zellen benötigt. E3-Proteine sind an der Modulation der Immunantwort durch den Wirt beteiligt, wobei sie den MHC-Transport an die Plasmamembran blockieren und die Lyse Adenovirus-infizierter Zellen durch den Tumornekrosefaktor (TNF) inhibieren. Durch Modifikation von E1- und E3-Genen werden Adenoviren attenuiert und können nur noch in humanen Helferzellen replizieren (ZKBS-Stellungnahme Az. 6790-10-28).
Ziel dieses Projektes ist die Etablierung und die Validierung einer Methode für den Nachweis von replikativen Adenoviren (Ad5) auf Oberflächen. Die auf zell- und molekularbiologischen Techniken basierende Methode soll anschließend in der Routineanalytik für die Überwachung von gentechnischen Arbeiten in gentechnischen Anlagen eingesetzt werden. Die Methode kann sowohl zur Überprüfung der Einhaltung einer guten mikrobiologischen Praxis als auch für die Detektion von vermehrungsfähigen Viren außerhalb der primären und sekundären Einsschließung der gentechnischen Anlage eingesetzt werden.
Für die Projektdurchführung sollen die Zelllinien HEK-293 (human embryonic kidney cells) und HELA (human cervix carcinoma cells) etabliert werden.
Durch die Durchführung von Wachstumsanalysen der eingesetzten Zelllinien soll die Flexibilität der Analytik gesichert werden. Die Untersuchung von Abstrichproben erfolgt anhand einer molekularbiologischen Methode, die – in Kombination mit den zellbiologischen Techniken – den Nachweis von Oberflächenkontaminationen mit vermehrungsfähigen Adenoviren erlaubt. Die sogenannte in culture real time PCR Technik basiert auf der Untersuchung von Ad5-spezifischen Gensequenzen in den Überstanden von Zellkulturen, welche mit dem Abstrichmaterial inokuliert wurden. Von dem Überständen werden zu unterschiedlichen Tagen nach Infektion Aliquots entnommen und nach einer Nukleinsäureextraktion die Anzahl der nachweisbaren adenoviralen Genomkopien mittels real time PCR bestimmt. Ein Anstieg der Ad5-spezifischen Gensequenzen belegt, dass replikative Adenoviren in der Abstrichprobe vorhanden sind.