Folgeprojektantrag „Nachweis bekannter Anwendungen der CRISPR/Cas-Technologie bei gentechnisch veränderten Organismen (2)
Kurzbeschreibung
Bislang verwendete Methoden zur Mutagenese waren meist ungerichtet, so dass die Modifikationen an mehr oder weniger zufälligen Stellen im Genom erfolgten. Durch die neuen molekularbiologischen Techniken (NMT), die unter dem Begriff „Genome Editing“ zusammengefasst werden, können nun Modifikationen gezielt und ortsspezifisch im Genom durchgeführt werden. Die hierfür am häufigsten genutzten Werkzeuge sind vor allem die Zink-Finger-Nukleasen (ZFN), transcription activator-like effector Nukleasen (TALEN) und seit einigen Jahren auch das CRISPR/Cas-System. Diese führen im Genom zu einem Doppelstrangbruch in der DNA, der anschließend auf verschiedene Weise durch den zelleigenen Reparaturmechanismus repariert werden kann. Dabei unterscheidet man drei Varianten: CRISPR/Cas -System. Diese führen im Genom zu einem Doppelstrangbruch in der DNA, der anschließend auf verschiedene Weise durch den zelleigenen Reparaturmechanismus repariert werden kann. Dabei unterscheidet man drei Varianten:
Site-Directed Nucleases-1 (SDN-1):
Der Doppelstrangbruch wird repariert, wodurch es zu einem Basenaustausch oder zu einer kleinen Insertion bzw. Deletion von einzelnen Basenpaaren kommen kann.
Site-Directed Nucleases-2 (SDN-2):
Gibt man zusätzlich ein DNA-Fragment mit einer kleinen, vorab festgelegten Mutation zum Reaktionsansatz hinzu, wird dieses DNA-Fragment vom Reparaturmechanismus als Vorlage für die Reparatur des Doppelstrangbruchs genutzt und die gewünschte Mutation in das Genom eingebaut.
Site-Directed Nucleases-3 (SDN-3):
Um größere DNA-Fragmente in das Genom ortsspezifisch zu integrieren, werden DNA -Fragmente zum Reaktionsansatz hinzugefügt, die eine Fremd-DNA enthalten. Diese Fremd-DNA ist flankiert von DNA-Abschnitten, die zur DNA im Bereich des Doppelstrangbruchs identisch sind. Auch hier nutzt der Reparaturmechanismus dieses hinzugefügte DNA-Fragment als Vorlage für die Reparatur des Doppelstrangbruchs, wodurch auch die Fremd-DNA in das Genom integriert wird (Transgen-Insertion).
Genome Editing findet bereits in der Humanmedizin, bei Mikroorganismen, sowie bei Tieren (z. B. Insekten) und Pflanzen Anwendung oder könnte in absehbarer Zukunft in diesen Anwendungsgebieten vermehrt genutzt werden. Werden nur kleine Veränderungen (z. B. Punktmutationen) erzeugt, sind die mit den neuen Techniken hergestellten Organismen ohne vorherige Kenntnis der genauen Modifikation analytisch nicht von herkömmlichen Organismen zu unterscheiden. Weiterhin kann nicht unterschieden werden, ob diese kleinen Veränderungen unter Anwendung klassischer Mutageneseverfahren (z. B. Chemikalien oder Bestrahlung) oder unter Einsatz des Genome Editings erzeugt wurden. Nach einem Urteil des Europäischen Gerichtshofs aus dem Jahr 2018 zählen alle mittels NMT hergestellten Organismen als GVO. Klassische Mutageneseverfahren sind hingegen vom EU-Gentechnikrecht ausgenommen (sog. Mutagenese-Ausnahme).
Bei diesem Projekt handelt es sich um ein Folgeprojekt des Projekts „Nachweis bekannter Anwendungen der CRISPR/Cas -Technologie bei gentechnisch veränderten Organismen“. Im Rahmen dieses Folgeprojekts sollen die bisher etablierten molekularbiologischen Verfahren zum Nachweis bekannter Punktmutationen und InDels weiterentwickelt und an verschiedenen genomeditierten Organismen getestet werden. Neben der „analytischen Überwachung gentechnischer Anlagen“ stehen auch Entwicklungen im Bereich „Überwachung von Saatgut auf genomeditierte Organismen“ im Fokus dieses Folgeprojekts. Zudem sollen auch Nachweismethoden für weitere, bisher noch nicht adressierte DNA-Modifikationen (z. B. Varianten: SDN-2 und SDN-3) entwickelt und etabliert werden. Neben den bisher verwendeten Methoden sollen auch andere molekularbiologische Nachweisverfahren (z. B. PCR mit hochauflösender Schmelzkurvenanalyse, Pyrosequenzierung und Next Generation Sequencing (NGS) bezüglich ihrer Eignung zur Charakterisierung und dem Nachweis von Punktmutationen und/oder kleinen InDels überprüft werden. Bei einem Vergleich dieser Methoden spielt neben der Spezifität und Sensitivität auch die Anwendbarkeit der Methoden für Routineanalysen im Rahmen der analytischen Überwachung gentechnischer Anlagen und/oder von Saatgut auf genomeditierte Organismen eine essentielle Rolle. Vor allem das Next Generation Sequencing (NGS) als Methode zur Detektion von Punktmutationen und InDels soll verstärkt angewandt werden.
Laufzeit: 01.12.2021-31.12.2024
Finanzielle Förderung: Dieses Forschungsprojekt wird durch das Bayerische Staatsministerium für Umwelt und Verbraucherschutz (StMUV) gefördert.