Behördenbezeichnung mit Staatswappen: Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit

Forschungsprojekt: Methodenentwicklung zur Quantifizierung von Markersubstanzen aus Ginseng (Panax ginseng, P. notoginseng, P. quinguefolius) und Ginkgo zur Beurteilung von funktionellen Lebensmitteln und Nahrungsergänzungsmitteln.

Kurzbeschreibung:

In einem funktionellen Lebensmittel darf der Gehalt an Ginseng-Extrakten oder Ginkgo biloba-Blättern keine pharmakologischen Wirkungen und Nebenwirkungen nach beschriebener Zubereitung des Lebensmittels besitzen. Aus diesem Grund werden in diesem Projekt eine Isolierungs- und Quantifizierungsmethode sowohl für die pharmakologisch wirksamen Ginsenoside, welche in den unterschiedlichen Ginseng Varietäten enthalten sind, als auch für die im Ginkgo biloba vorkommenden Terpentrilactone und toxikologisch bedenklichen Ginkgolsäuren entwickelt.

Ginseng Varietäten

Ziel dieses Projektes ist die Isolierung der pharmakologisch wirksamen Markersubstanzen des Ginsengs, den Ginsenosiden, sowie die Entwicklung einer Quantifizierungsmethode dieser Substanzen in funktionellen Lebensmitteln und Nahrungsergänzungsmitteln. Da bei dem Einsatz der HSCCC keine irreversiblen Adsorptionsvorgänge mit der stationären Phase stattfinden und sie meist gute Ergebnisse zur Isolierung von Naturstoffen liefert, wird in dieser Arbeit besonderen Wert auf eine Isolierung der Ginsenoside mit Hilfe der HSCCC gelegt. Es sind jedoch einige Fakten im Laufe des Projektes aufgetreten, die bei dem Einsatz der HSCCC als Isolierungsmethode berücksichtigt werden müssen. Ein Nachteil der HSCCC ist, besonders für die Trennung von Ginsenosiden, die zeitaufwendige und arbeitsintensive Suche eines geeigneten Lösungsmittel-Trennsystems. Die meisten Trennsysteme erreichen nur eine Vorfraktionierung der Verbindungen, aber erleichtern dadurch weitere Aufarbeitungsschritte. Ein weiteres Problem stellt die Detektion der Ginsenoside während der HSCCCTrennung dar. Die Detektion kann einerseits über die gebundenen Zucker mittels RIDetektor, und andererseits über die Doppelbindung erfolgen, die bei 205-210 nm absorbiert. Die UV-Chromatogramme können jedoch nicht zur Fraktionierung herangezogen werden, da durch die Grenzflächenaktivität der Ginsenoside ein Teil der stationären Phase mitgerissen wird. Dies hat zur Folge, dass keine deutlichen Peaks erkennbar sind. Dieser Effekt ist bei der RI-Detektion weniger stark ausgeprägt, was für die Beurteilung der Trennung von Vorteil ist. Eine Schwäche der RI-Detektion ist, die genaue Einstellung des Intensitätsbereiches zu finden, was eine vorherige Durchführung voraussetzt. Die RI-Detektion ist jedoch hervorragend für die Schwerkraft-Säulenchromatographie und MPLC geeignet, weil sie wenigen Schwankungen unterliegt und kleinste Mengen detektiert. Dennoch stellt die Dünnschichtchromatographie die aussagekräftigste, aber zeitaufwendigste Detektions-Variante dar.

In dieser Arbeit können neun verschiedene Markersubstanzen aus den Ginseng Varietäten Panax notoginseng, weißer Panax ginseng und Panax quinquefolius mit verschiedenen Methoden isoliert werden.

Panax notoginseng

Es werden über die HSCCC vier saubere Ginsenoside isoliert und stehen als Referenzmaterial zur Verfügung. Es handelt sich hierbei um die Ginsenoside Rb1, Re, Rg1 und R1.
Panax ginseng (Weißer Ginseng)

Die Substanzen Rb2, Rg1, Rf, Ro und das Panaxydol können mit der HSCCCTechnik ohne anschließende Aufreinigung isoliert werden, jedoch mit unterschiedlichen Lösungsmittel-Trennsystemen. Zur Isolierung des Ginsenosids Re aus den Fraktionen der HSCCC-Trennung wird eine Aufreinigung mittels Schwerkraft-Kieselgel-Säule benötigt. Bei den isolierten Verbindungen handelt es sich um wichtige Markersubstanzen des Ginsengs.

Es hat sich gezeigt, dass Rg1 in allen Varietäten enthalten ist, wobei der Gehalt in Panax notoginseng relativ hoch ist. Das Ginsenosid Re ist ebenfalls überall enthalten, ist jedoch beim Panax quinquefolius am höchsten. Im Panax notoginseng und Panax ginseng ist das Ginsenosid Rf (Court, 2000) zu finden. Da das Ginsenosid Rf in Panax quinquefolius (Amerikanischer Ginseng) jedoch nicht enthalten ist, stellt es eine Möglichkeit dar, amerikanischen von chinesischem Ginseng zu unterscheiden. Die isolierten Ginsenoside Rb2, Rg1, Rf, Re und Ro können als Standard-Substanzen eingesetzt werden, und damit zur Qualifizierung und Quantifizierung dienen.

Panax quinquefolius

Aus Panax quinquefolius ist es möglich die Ginsenoside Rc, Re und F11 direkt mittels der HSCCC zu isolieren. Das Pseudoginsenosid F11 ist eine wichtige Markersubstanz von Panax quinquefolius, da es zur Unterscheidung von Amerikanischem (Panax quinquefolius) und Asiatischem Ginseng (Panax ginseng) herangezogen werden kann. In Verbindung mit dem Gehalt an Ginsenosid Rf ist eine Aussage, um welche der beiden Ginseng-Varietäten es sich handelt, möglich. Im Handel sind nordamerikanische Ginsengwurzeln fünf- bis zehnfach teuerer als die Wurzeln des Asiatischen Ginsengs. Daher ist eine eindeutige Möglichkeit zur Unterscheidung zwischen den beiden Ginseng-Varietäten, besonders im Hinblick auf eine Verfälschung, von großem Interesse.

Zur Trennung und Quantifizierung der Ginsenoside über die HPLC wird eine Methode entwickelt, welche eine Luna C18 Säule als stationäre Phase und Acetonitril/Wasser als mobile Phase verwendet. Der erarbeitete Gradient (siehe 5.1.1.2.) trennt die Ginsenoside voneinander ab, so dass eine Quantifizierung ermöglicht wird. Zudem ist es aufgrund der Länge des Gradienten und des großen Anteils an organischem Lösungsmittel möglich, komplexere Proben zu analysieren. Lipophilere Verbindungen werden so vollständig von der Säule eluiert, wodurch diese vor Verschmutzungen geschützt wird. Doch nicht alle Proben, die Ginsengwurzeln enthalten, können direkt mittels LCMS/ MS analysiert werden. Viele Lebensmittel wie z. B. Früchte- oder Kräutertees, bei denen Ginseng nur einen gering konzentrierten Bestandteil ausmacht, müssen vor ihrer Analyse aufgearbeitet werden. Hierbei werden Störsubstanzen, welche Matrixeffekte verursachen können, abgetrennt. Zusätzlich kann bei Proben, in denen nur Spuren von Ginsenosiden enthalten sind, auf diesem Wege die Ginsenosid- Konzentration erhöht werden. Eine Möglichkeit der Probenaufarbeitung ist der Einsatz von C18-Kartuschen. Sie sind unter Verwendung von Nanopure® als Waschlösung und Methanol als Elutionslösung für eine nachfolgende quantitative Analyse von Ginsengproben geeignet. Wird das Elutionsvolumen gering gehalten, ist eine Konzentrierung der Ginsenoside in der Probelösung möglich. Es muss jedoch berücksichtig werden, dass jede Probe eine auf sie spezialisierte Probenaufarbeitung benötigt.

Ginkgo biloba

Das zweite Ziel dieses Projektes ist die Isolierung der pharmakologisch wirksamen Terpentrilactone und der toxikologisch bedenklichen Ginkgolsäuren, sowie die Entwicklung einer Quantifizierungsmethode dieser Substanzen in funktionellen Lebensmitteln und Nahrungsergänzungsmitteln. Da bei dem Einsatz der HSCCC keine irreversiblen Adsorptionsvorgänge mit der stationären Phase stattfinden und sie meist gute Ergebnisse zur Isolierung von Naturstoffen liefert, wird auch in diesem Teil der Arbeit besonderen Wert auf eine Isolierung der TTL und Ginkgolsäuren mit Hilfe der HSCCC gelegt. Für die Analyse und Isolierung der Terpentrilactone ist zunächst ihre Detektion sehr schwierig, da es sich bei ihnen um sehr säure- und hitzestabile Verbindungen handelt. Aus diesem Grund sind universelle Sprühreagenzien wie das Anisaldehyd- Schwefelsäure-Reagenz nach STAHL oder die ethanolische Schwefelsäure zur Detektion nicht einsetzbar. Zusätzlich gestalten sich die Komplexität des Ethylacetat-Extraktes und die geringe Konzentration der TTL in diesem zu problematisch, um sie direkt aus dem Extrakt über die HSCCC zu isolieren. Aus diesem Grund wird der Ethylacetat-Extrakt über eine Sephadex-LH-20-Säule vorgetrennt und die Terpentrilactone somit aufkonzentriert. Das Bilobalid kann anschließend über eine HSCCC-Trennung und darauf folgender Aufreinigung über eine Kieselgelsäule isoliert werden. Es werden 28 mg der Substanz mit einer Reinheit von ca. 96 % erhalten. Die Strukturaufklärung erfolgt über LC-MS/MS, 1H- und 13C-Kernresonanzspektroskopie. Das isolierte Bilobalid kann als Standardsubstanz für die Quantifizierung eingesetzt werden. Eine Isolierung der Ginkgolsäuren über die HSCCC ist aufgrund der Grenzflächenaktivität und der Lipophilie nicht erfolgreich. Für die Abtrennung der Ginkgolsäuren wird der Hexan-Extrakt mit dem System Hexan/Ethanol/Wasser/Ammoniak 8:4:2:0,1 (v:v:v:v) aufgereinigt. Durch eine Deprotonierung können die Ginkgolsäuren vollständig in die wässrige Phase überführt und somit von lipophileren Substanzen getrennt werden. Da der Extrakt neben den Ginkgolsäuren weitere Substanzen, wie beispielsweise die Chlorophylle, enthält, wird dieser anschließend zweimal über eine PVA-Säule aufgetrennt. Dadurch wird eine Fraktion gewonnen, die mehrere Ginkgolsäuren (C17:1, C15:1 und C13:0) beinhaltet. Mit etwa 81 % ist die Ginkgolsäure C17:1 die Hauptkomponente dieser Fraktion. Die beiden anderen Säuren sind mit einem Anteil von jeweils 9,5 % enthalten. Die erhaltene Fraktion kann als Mischstandard zur Quantifizierung der toxikologisch bedenklichen Ginkgolsäuren in Lebensmitteln und Nahrungsergänzungsmitteln eingesetzt werden.

In einem funktionellen Lebensmittel darf der Gehalt an Ginkgo biloba-Blättern keine pharmakologischen Wirkungen und Nebenwirkungen nach beschriebener Zubereitung des Lebensmittels besitzen. Aus diesem Grund wird eine Quantifizierungsmethode sowohl für die pharmakologisch wirksamen Terpentrilactone als auch toxikologisch bedenklichen Ginkgolsäuren entwickelt. Für die Quantifizierung der Terpentrilactone wird die HPLC zur Trennung mit anschließender Detektion mittels der Massenspektrometrie verwendet. Das eingesetzte Gerät ist ein ESI-MS mit Ion-Trap-Detektion. Der Grund für den Einsatz der teuren Massenspektrometrie liegt in der Detektion der TTL. Durch das fehlende Chromophor und den geringen Brechungsindex ist der universell einsetzbare Massenspektrometer mit seiner geringen Nachweisgrenze am besten zur Bestimmung geeignet. Die Bestimmung erfolgt im negativen Modus, in dem die Ginkgolsäuren durch die leichte Eliminierung eines Protons aus der Säurefunktion eine sehr geringe Nachweisgrenze besitzen und somit, trotz geringer Konzentration in den Proben, mit der gleichen Methode und Probenaufarbeitung wie für die Terpentrilactone bestimmt werden können. Zur Trennung und Quantifizierung der Terpentrilactone über die HPLC wird eine Methode entwickelt, welche ebenfalls die Luna C18 Säule als stationäre Phase, jedoch Methanol/Wasser als mobile Phase verwendet. Der erarbeitete Gradient trennt die Terpentrilactone vollständig voneinander ab. Zudem ist es aufgrund der Länge des Gradienten und des großen Anteils an organischem Lösungsmittel möglich, die Ginkgolsäuren ebenfalls zu eluieren und somit mit dieser Methode zu bestimmen. Zusätzlich ermöglicht der Gradient die Analyse von komplexeren Proben. Lipophilere Verbindungen werden vollständig von der Säule eluiert, wodurch diese vor Verschmutzungen geschützt wird.

Laufzeit: 2004-2006