Forschungsprojekt: Anwendung der immunomagnetischen Separation zur Aufkonzentrierung und Isolierung verschiedener pathogener Mikroorganismen aus Milchprodukten
Kurzbeschreibung:
Cronobacter-Pathatrix-Nachweis
Cronobacter spp. (früher Enterobacter sakazakii) sind stäbchenförmige Gram-negative Bakterien der Familie Enterobacteriaceae. Eine orale Infektion kann bei Säuglingen schwere klinische Krankheitsbilder wie Blutvergiftung, Hirnhautentzündung und nekrotisierende Enterokolitis verursachen. Säuglingsanfangsnahrung gilt als potentielle Infektionsquelle für Cronobacter spp.. In der Regel ist die gefundene Keimzahl in getrockneter, pulverförmiger Säuglingsnahrung sehr gering und eine Vermehrung in Milchpulver bislang nicht beobachtet worden. Erst durch unkorrekte Zubereitung der trinkfertigen Nahrung bzw. bei längerer Lagerung der Milchnahrung bei Raumtemperatur, nimmt die Gefahr einer unfreiwilligen Keimvermehrung zu. Die minimale Infektionsdosis von Cronobacter spp. bei Säuglingen ist nicht bekannt. Erkrankungen wurden aber auf Gehalte an Cronobacter spp. von wenigen KbE pro 100 g Säuglingsnahrung zurückgeführt. Es besteht ein Risiko, dass eine geringe Erregeranzahl mit der konventionellen mikrobiologischen Diagnostik alleine nicht nachweisbar ist.
Daher war es Ziel dieser Arbeit mittels Immunomagnetischer Separation (IMS) Cronobacter spp. aus der bakteriellen Voranreicherung zu konzentrieren, durch Poolen eine größere Probenanzahl zu analysieren und die Voranreicherungszeit mittels IMS auf 6 Stunden zu reduzieren.
Zunächst wurde die Nachweisgrenze des Cronobacter-Pathatrix-Systems in Milchpulverproben ermittelt. Ohne Anreicherung detektierte das System die Bakterien in einer künstlich kontaminierten Probe mit 103 Cronobacter-Keimen (d.h. 102 Keime/g Milchpulver). Nach 6 Stunden Anreicherung, wie vom Pathatrix-Hersteller empfohlen, ist die Wiederfindung höher und erheblich verbessert mit einem Wert von 1 Keim pro 10 g Milchpulver. Ohne IMS sind 20 Stunden Anreicherung erforderlich für das kulturelle Verfahren, um die Nachweisgrenze von 1 Keim pro 10 g Milchpulver zu erreichen. Im Vitaminpulver ist eine Anreicherung von mindestens 4 Stunden erforderlich, um die Bakterien in einer künstlich kontaminierten Probe mit 102 Cronobacter-Keime pro 25 g Vitaminpulver zu entdecken. Die Sensitivität des Systems lässt beim Poolen von 5 Milchpulverproben nach. Mehr feste Materie (25 g anstatt 10 g Pulver beim einzelnen Probenansatz) zirkuliert durch das Pathatrix-System, der Durchfluss erscheint dadurch gemindert. Es ist durchaus möglich, dass die Keime mehr an dem Pulver gebunden bleiben und sich nicht so leicht an die Beads binden. Die Menge an festem Pulver scheint einen Einfluss auf die Nachweisgrenze des Pathatrix-Systemes zu haben. Das Cronobacter-Pathatrix-System erfasst alle sieben Spezies der Gattung Cronobacter sowie die 3 Enterobacter Spezies. Die Morphologie sowie die Färbung der Kolonien ist entscheidend, um die zwei Gattungen differenzieren zu können. Die Anwendung dieses IMS-Verfahrens eignet sich in der Routine gut für Milchpulverproben und ermöglicht den Nachweis von Cronobacter spp. bereits nach sechs Stunden Voranreicherung. Der gesamte Zeitaufwand bis zur Detektion und Isolierung des Erregers kann dadurch von bisher 3 Tagen auf 2 Tage verkürzt werden.
Mit dem Pathatrix Verfahren können des weiteren geringere Erregerkonzentrationen nachgewiesen werden und die inhibitorischen Matrix-Effekte bei der PCR vermieden werden, da der Erreger aus der Voranreicherung isoliert wird.
Listeria Pathatrix-Nachweis
Listeria monocytogenes sind Gram-positive bewegliche kurze Stäbchen der Gattung Listeria. Sie können bei Kleinkindern oder immun geschwächten Personen Listeriose auslösen, eine meldepflichtige Infektionskrankheit. Bei Menschen mit geschwächter Immunabwehr und Schwangeren kann eine Listeriose sehr gefährlich werden. Die Infektion erfolgt durch Aufnahme von kontaminierter Nahrung, vor allem Fleisch-, Fisch und Milchprodukte. Für den Nachweis von L. monocytogenes sind zuerst 3 Tage Anreicherung erforderlich (20h für die erste Anreicherung, 48h für die zweite Anreicherung) und 1 Tag Bebrütung nach Ausstrich auf Selektivagar. Ziel dieser Arbeit mittels IMS war es die Anreicherungszeit von L. monocytogenes auf 20h zu reduzieren.
Die Nachweisgrenze des Listeria spp.-Pathatrix-Verfahrens in bakteriellen Voranreicherungen von Schmelzkäse bzw. geräuchertem Fisch ist niedriger als beim Nachweis von Cronobacter mittels IMS. Ohne Anreicherung detektierte das Listeria spp.- Pathatrix-Verfahren L. monocytogenes in einer Probe mit ca. 106–107 Keimen (vgl. zu 103 Keimen beim Cronobacter-Pathatrix Verfahren). In der Anleitung des Listeria spp.-Pathatrix-Verfahrens wird keine Verkürzung der Voranreicherungszeit wie bei Cronobacter spp. empfohlen. Man musste 103 Keime 20 Stunden lang bebrüten, um sie wieder detektieren zu können. Auch könnte die größere Menge an fester Probenmatrix (25 g Probe bei Listeria spp. anstatt 10 g Milchpulverprobe beim Cronobacter-Verfahren) einen negativen Einfluss auf das System haben. Das Poolen zeigte letztendlich die gleiche Sensitivität wie beim Nachweis von L. monocytogenes in Einzelproben. Die Menge an Matrix war in der gepoolten Probe dieselbe wie beim Einzelansatz (25 g Lebensmittel).
Das Prinzip der beiden Konzentrierungsverfahren ist leicht unterschiedlich: bei den E. sakazakii-beads handelt es sich um eine elektrostatische Verbindung der Keime an kationische Beads, bei den Listeria spp.-beads handelt es sich um eine spezifische Antigen-Antikörper-Bindung. Daher können die Ergebnisse nicht 1:1 miteinander verglichen werden. Insgesamt zeigt sich, dass das Verfahren der Immunomagnetischen Separation für Listeria spp. bei festen komplexen Matrices wie Schmelzkäse, Fisch und Hackfleisch schwerer einsetzbar ist, als für E. sakazakii bei der Aufkonzentrierung einer Milchpulver-Anreicherung.
Laufzeit: 2009