Forschungsprojekt: Entwicklung von Strategien für die Überwachung gentechnischer Arbeiten mit Vaccinia-Viren
Kurzbeschreibung
Gentechnische Arbeiten mit Vaccinia-Viren sind weit verbreitet. Vaccinia-Viren werden direkt als Impfstoff gegen den verwandten Pockenerreger (Variola major; engl. smallpox) eingesetzt und weiterhin als ein "Prototyp" eines DNA-Vakzinierungsvektors (Impfvektors) betrachtet. In der Grundlagenforschung besitzen Vaccinia-Virus- (VACV) basierte virale Vektoren eine breite Anwendung in Genexpressionsstudien und bei der Entwicklung von Methoden zur Tumordiagnostik und -therapie. Vaccinia-Viren verfügen über das größte Wirtsspektrum innerhalb der Familie der Pockenviren und sind in der Lage, Zellen von Säugetieren, Vögeln sowie Reptilien zu infizieren und sich darin zu vermehren. Sie werden für die Forschung stark angereichert und sind auch in getrocknetem Zustand sehr stabil und infektiös. Obwohl eine Infektion mit Vaccinia-Viren meist zu milden Krankheitsverläufen führt, kann es bei Infektionen von immunsupprimierten Personen zu schweren Krankheitsverläufen kommen. Gentechnische Arbeiten mit rekombinanten Vaccinia-Viren werden in die Sicherheitsstufe 2 eingestuft. Eine Ausnahme stellen gentechnische Arbeiten mit dem Modifizierten Vaccinia Virus Ankara- (MVA-) Stamm dar. Dieser häufig als Impfvektor benutzte Stamm ist stark attenuiert und besitzt nicht mehr die Fähigkeit zur Replikation in menschlichen Zellen. Entsprechende gentechnische Arbeiten werden daher in die Sicherheitsstufe 1 eingestuft.
Im Rahmen dieses Projekts wurde eine Stufenanalytik für die Überwachung gentechnischer Arbeiten mit vacciniaviralen Vektoren entwickelt. Die Analyseverfahren ermöglichen die Differenzierung und Identifizierung von Proben, welche Vacciniaviren enthalten könnten.
Es wurde eine Real-Time PCR entwickelt, welche sowohl VACV als auch MVA wie auch alle anderen Spezies der Orthopocken-, Parapocken-, Molluscipocken und Avipockenviren simultan detektieren kann, theoretisch also auch die echten Pocken, welche seit 1980 offiziell ausgerottet sind, aber auch sogenannte neu auftretende zoonotische Erreger wie das Affenpockenvirus.
Weiterhin wurde ein auf die 'Multiplex ligationsabhängige Sondenamplifikation' (MLPA) basierendes System zur Differenzierung und Charakterisierung von vacciniaviralen Vektoren angewandt. Diese Methode ermöglicht die Differenzierung zwischen VACV und MVA und überprüft gleichzeitig die Unversehrtheit gängiger Transgen-Integrationsorte.
Die MLPA-basierte Methode zur Differenzierung vacciniaviraler Vektoren wurde bei der Fachzeitschrift „Applied Biosafety“ unter dem Titel „Characterization of recombinant vaccinia viruses by MLPA technology“ veröffentlicht (Applied Biosafety Vol. 19, No. 3, 2014).
Die Real-Time PCR zum Nachweis von Pockenviren und davon abgeleiteten viralen Vektoren konnte ebenfalls bei der Fachzeitschrift „Applied Biosafety“ unter dem Titel „Multiplex Real-time PCR Assay for the Detection and Differentiation of Poxviruses and Poxvirus Vectors“ veröffentlicht werden (Applied Biosafety Vol. 20, No. 4, 2015).
Laufzeit: 2012 bis 2014
Finanzielle Förderung: Dieses Forschungsprojekt wurde durch das Bayerische Staatsministerium für Umwelt und Verbraucherschutz (StMUV) gefördert.