Diagnostik
Bei der Diagnostik muß zwischen dem Erregernachweis und dem Nachweis von Antikörpern unterschieden werden.
Erregernachweis
Als Untersuchungsmaterial eignen sich Blut (Liquor) im Stadium der Leptospirämie, sowie im weiteren Verlauf der Erkrankung Urin, eventuell auch Organe wie z. B. der Glaskörper beim Pferd oder Nieren bei anderen Spezies.
Neben dem Direktnachweis in der Dunkelfeldmikroskopie kommt in erster Linie die Anzucht des Erregers in Frage.
Um sicher zu stellen, dass die Leptospiren den Transport überleben, empfiehlt sich die Verwendung von Transportmedien, die vom LGL bezogen werden können. Aus den Transportmedien wird Material auf verschiedene Nährmedien, u. a. mit Hemmstoffen, verimpft. Die beimpften Medien werden bis zu 6 Monaten bei 29 °C bebrütet und regelmäßig im Dunkelfeldmikroskop kontrolliert.
Die Isolierung von Leptospiren am LGL gelang bereits in mehr als 300 Fällen. Es wurden Leptospiren aus Proben von Menschen, Hunden, Rindern, Pferden, Schweinen, Ratten und Mäusen isoliert und kultiviert. Speziell für Rinder, Pferde, Schweine und Hunde konnten daraus stallspezifische Impfstoffe hergestellt werden.
| Tierart | Material | Serogruppe | Anzahl |
|---|---|---|---|
| Biber | Urin | Icterohaemorrhagiae*4 | 1 |
| Hund | Urin | Sejroe *1 | 28 |
| Maus | Urin | Sejroe *2 | 2 |
| Mensch | Urin | Canicola | 1 |
| Grippotyphosa *3 | 1 | ||
| Icterohaemorrhagiae *4 | 2 | ||
| Blut | Icterohaemorrhagiae *4 | 1 | |
| Pferd | Auge | Grippotyphosa *5 | 302 |
| Australis *6 | 31 | ||
| Sejroe*1 | 10 | ||
| Pomona *7 | 14 | ||
| Javanica *8 | 5 | ||
| Icterohaemorrhagiae *4 | 2 | ||
| Pyrogenes*9 | 1 | ||
| Urin | Grippotyphosa *5 | 1 | |
| Ratte | Urin | Icterohaemorrhagiae *4 | 4 |
| Niere | Icterohaemorrhagiae *4 | 1 | |
| Rind | Urin | Sejroe *10 | 18 |
| Australis*11 | 1 | ||
| Schwein | Urin | Sejroe *12 | 2 |
| Pomona *13 | 1 |
*1 = u. a. Serovar Saxkoebing;
*2 = Serovar Saxkoebing;
*3 = Serovar Grippotyhosa;
*4 = Serovar Icterohaemorrhagiae;
*5 = u. a. Serovar Grippotyhosa;
*6 = u. a. Serovare Australis, Bratislava, Lora und Muenchen;
*7 = u. a. Serovar proechimys or;
*8 = u. a. Serovare sorexjalna und poi;
*9 = Serovar pyrogenes;
*10 = u. a. Serovar Hardjo und Hardjobovis
*11 = Serovar Muenchen
*12 = Serovar Hardjo
*13 = Serovar Mozdok
Eine weitere Möglichkeit, den Erreger über sein Genom nachzuweisen, bietet die PCR, die ebenfalls am LGL durchgeführt wird.
Antikörpernachweis (indirekter Erregernachweis)
Von den zahlreichen, zur Verfügung stehenden, serologischen Methoden werden am LGL die MAR sowie der ELISA eingesetzt.
Mikroagglutinationsreaktion (MAR) bzw. englisch Micro Agglutination Test (MAT):
Der MAR ist der Goldstandard in der serologischen Leptospirendiagnostik, bisher unübertroffen in seiner Spezifität und daher der Referenztest, an dem sich alle anderen serologischen Methoden messen lassen müssen.
Serum und Antigen (Leptospirenlebendkulturen) werden zu gleichen Teilen vermischt, ein bis zwei Stunden bei
20 bis 30 ºC inkubiert und anschließend unter dem Dunkelfeldmikroskop beurteilt. Bei negativem Ergebnis ist ein dichter Bakterienrasen sichtbar. Als positiv gewertet wird die Reaktion, wenn wenigstens die Hälfte der Bakterien durch Agglutination mit den dann vorhandenen Antikörpern gebunden ist (deutlich dunklerer Hintergrund, weniger dichter Bakterienrasen, sichtbare Agglutinate).
In einem Vorversuch mit einer Verdünnung von 1:50 wird das zu untersuchende Serum gegen die, bei der jeweiligen Spezies wichtigsten, Leptospirenserovare untersucht. Erfasst werden Antikörper der Klasse IgM, IgG sowie auch IgA. Bei einem positiven Befund wird das Serum dann im Hauptversuch gegen die reagierende Leptospirenserovar austitriert. Die letzte Verdünnungsstufe, bei der eine positive Reaktion zu beobachten ist, wird schließlich als Titer angegeben. In der WHO-Referenzmethode gilt ein Titer von 1:100 als grenzwertig positiv, wobei ein einzelner Titer wenig aussagekräftig ist. Besser ist die Untersuchung eines Serumpaares im Abstand von ein bis zwei Wochen. Spezifität und Sensitivität der MAR sind hoch.
Die Auswahl der Serovare für die jeweilige Spezies ist zum einen von der epidemiologischen Situation des betreffenden Landes, bzw. der jeweiligen Region, zum anderen natürlich von den Kosten abhängig. Wird auf alle, zur Verfügung stehenden, Serovare untersucht ist man auf der sicheren Seite, treibt aber die Kosten enorm in die Höhe. Somit gilt auch hier, "so viel wie nötig, so günstig wie möglich" und untersucht auf die regional am häufigsten vorkommenden Serovare.
| Spezies Serovar |
Hund S=7 |
Mensch S=17 |
Pferd S=8 |
Rind S=6 |
Schaf/Ziege S=5 |
Schwein S=7 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Australis | + | |||||
| Autumnalis | + | |||||
| Bataviae | + | |||||
| Ballum | + | |||||
| Bratislava | + | + | + | + | + | + |
| Canicola | + | + | + | + | + | |
| Copenhageni | + | + | + | + | + | + |
| Grippotyphosa | + | + | + | + | + | + |
| Hardjo | + | + | + | + | + | |
| Hebdomadis | + | |||||
| Icterohaemorrhagiae | + | |||||
| Javanica | + | + | ||||
| Pomona | + | + | + | + | + | |
| Pyrogenes | + | + | ||||
| Saxkoebing | + | + | ||||
| Sejroe | + | + | ||||
| Tarassovi | + | + | + |
Zur Durchführung der MAR werden die, in Tabelle 5 benannten Leptospirenserovare, ausgehend von den entsprechenden Referenzstämmen, fortwährend in ausreichender Menge kultiviert. Das LGL testet jährlich etwa 17.000 Proben
ELISA
Vorteil des ELISA gegenüber der MAR ist, dass er einfacher und auch objektiver abgelesen werden kann. Außerdem besitzt er eine höhere Sensitivität und liefert durch die Verwendung enzymmarkierter Anti-Spezies lgG, IgM und IgA Antikörper neben der Aussage "positiv" bzw. "negativ", die Information "lange zurückliegende" oder "erst kürzlich erworbene" Infektion (IgM Antikörper treten schon ab dem 3. Tag einer Infektion auf). Um mit einem serovarspezifischen ELISA zu arbeiten, werden Mikrotiterplatten jeweils mit allen, in der Diagnostik eingesetzten, Leptospirenantigenen beschichtet. Bedingt durch den hohen Arbeits- und Kostenaufwand bleibt der ELISA speziellen Fragestellungen vorbehalten.
Sowohl für die MAR als auch den ELISA wird Serum oder Plasma benötigt. Grundsätzlich eignen sich alle Blutproben, ohne oder mit gerinnungshemmenden Zusätzen. Es kann auch Cerebrospinalflüssigkeit untersucht werden. Urin ist zum Antikörpernachweis weitestgehend ungeeignet. Auch Kammerwasser bzw. Glaskörperflüssigkeit wird im Rahmen der Diagnostik der ERU auf Antikörper getestet.